UV1700PC紫外可见分光光度计测定蛋白质含量方法

组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩

合形成肽链，蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分

子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法

并做相应方法学验证，同时应尽可能选用与待测定品种蛋

白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。

*法凯氏定氮法

本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和

硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨

与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸

液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮

量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

本法灵敏度较低，适用于0.2?2. O m g氮的测定。氮

转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差

异会稍有区别。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备，

生物制品按如下方法操作。

精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末

时，应复溶后量取）适量，用0.9%氯化钠溶液定量稀

释，制成每l m l中含氮量约l m g的溶液，精密量取lml,

作为总氮供试品溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制

备，除另有规定外，照附注项下钨酸沉淀法操作，即得。

测定法除另有规定外，按测定法（1 ) 操作，生物

制品按测定法（2 ) 操作。

(1) 本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白

质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品

溶液适量，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（通则0704第

二法或第三法）测定供试品溶液的含氮量。除另有规定

外，氮转换为蛋白质的换算系数为6. 25。

(2) 本测定法适用于添加无机含氮物质及有机非蛋白

质含氮物质的供试品。除另有规定外，精密量取各品种项

下规定的总氮及非蛋白氮供试品溶液适量，分别置凯氏定

氮瓶中，照氮测定法（通则0704第二法或第三法）测定，

以__________总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量。除另

有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6. 25。

【附注】非蛋白氮供试品溶液制备常用方法

钨酸沉淀法精密量取供试品（如供试品为冻干制剂

或固体粉末时，应复溶后量取）适量（蛋白质含量不高于

0. 2 g ) ,置20ml量瓶中，加水10ml，加10%钨酸钠溶液

2.0ml，0. 33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度。或精密

量取上述供试品2ml，加水14.(ftnl，10% 钨酸钠溶液

2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2. Oml。摇匀，静置3 0分钟，

滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得（可依据蛋白质浓度

适当调整1 0 %钨酸钠溶液及O.33mol/L硫酸溶液用量，

使钨酸终浓度保持1% )。

三氯醋酸沉淀法精密量取供试品（如供试品为冻干

制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适量（蛋白质含量

6?12mg)，加等体积的1 0 %三氯醋酸溶液，混匀，静置

3 0分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得（可依据

蛋白质浓度适当调整1 0 %三氯醋酸溶液用量，使三氯醋

酸终浓度保持5% )。

第二法福林酚法（Lowry法）

本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中

与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂

的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚

试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸述原呈蓝

色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，

以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试

品中蛋白质的含量。

本法灵敏度高，测定范围为20?250Mg。但对本法产

生干扰的物质较多，对双缩脲反应产生干扰的离子，同样

容易干扰福林酚反应，且影响更大。如还原物质、酚类、

枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖

类、甘油等均有干扰作用。

除另有规定外，按方法1操作；如有干扰物质时，除

另有规定外，按方法2 操作并需经方法学验证。方法1:

试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，

加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水

50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将

两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水

至 500mlo

对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白

(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并

制成每l m l中含0. 2m g 的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备

(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。

测定法 精密量取对照品溶液0. Oml、0. 2ml、

0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml (对照品溶液取用量可在

本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各

加水至1.0ml，再分别加人碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置1 0分钟，各加人福林酚试液[取福林试液中的贮

备液（2mol/L酸浓度）1 — 16] 4.0ml，立即混匀，室温

放置3 0分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401) ，在

6 5 0 n m的波长处测定吸光度；同时以0 号管作为空白。以

对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。

另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程

计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，

即得。

方法2:

测定前将脱氧胆酸盐-三氯醋酸加人样品中，通过将

蛋白质沉淀来去除干扰物质。这种方法也可用于将稀溶液

中的蛋白质浓集。

试剂试液A 取1 % 氢氧化钠溶液200ml与5%碳

酸钠溶液200ml混合，加水稀释至500ml。

试液B 取2. 9 8 %二水合酒石酸二钠溶液100ml与

1.25%硫酸铜溶液100ml混合，加水稀释至250ml，临用

新制。

试液C 取试液A 与试液B 按50 : 1 的比例混合，临

用新制。

福林酚试液取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓

度）1— 2 (所配得的福林酚试液应满足以下要求：取供试

品溶液1ml，加试液C 5 m l和配好的福林酚试液0. 5ml,

所得溶液的p H 值应为10. 3±0. 3。若溶液p H 值超出范

围，应适当调整福林酚试液的稀释倍数）。

去氧胆酸钠试液取去氧胆酸钠适量，加水制成每

l m l中含1. 5m g 的溶液。对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白

(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品适量，加水分

别制成每 lml 中含 0. OOmg、0. Olmg、0. 02m g、0. 03mg、

0. 04m g、0.05mg的溶液（对照品溶液浓度可在本法测定

范围内进行适当调整）。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备

(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。

测定法精密量取各对照品溶液1.0ml，分别置玻璃

试管中，加人去氧胆酸钠试液0.1ml，涡旋混勻，室温放

置10分钟，加人7 2 %三氯醋酸溶液0.1ml，涡旋混匀，

在3000g■条件下离心3 0分钟，轻轻倒出上清液，用吸管

将剩余液体移除。蛋白质沉淀用试液C lml复溶后，再加

人试液C 5ml，混匀，室温放置10分钟，加人福林酚试液

0 .5ml,立即混匀，室温放置3 0分钟，照紫外-可见分光

光度法（通则0401)，在7 5 0 n m的波长处测定吸光度；同

时以0 号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸

光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml，

同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓

度，并乘以稀释倍数，即得。

第三法双缩脲法

本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性

溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色

深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲

线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

本法快速、灵敏度低，测定范围通常可达1?10mg。

本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓

冲液和某些氨基酸等。

试剂双缩脲试液取硫酸铜1.5g、酒石酸钾钠

6. O g和碘化钾5.0g，加水500ml使溶解，边搅拌边加人

1 0 %氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml,混匀，

即得。

对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白

(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并

制成每l m l中含1 0 m g的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备

(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。

测定法 精密量取对照品溶液0. Oml、0. 2ml、

0.4ml、0.6ml、0.8ml、1. Oml (对照品溶液取用量可在

本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各

加水至1.0ml，再分别加人双缩脲试液4. Oml，立即混勻，

室温放置3 0分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401),

在5 4 0 n m的波长处测定吸光度；同时以0 号管作为空白。

以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方

程。另精密量取供试品溶液适量，同法操作。从线性回归

方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，

即得。

第四法2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法（B C A法）

本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为

C u +，2，2〔联喹啉-4，4'-二羧酸（B C A ) 与Cu4■结合形成紫

色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正

比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供

试品中蛋白质的含量。

本法灵敏度较高，测定范围可达80?400Mg。本法测

定的供试品中不能有还原剂和铜螯合物，否则干扰测定。

试剂铜- B C A试液取2，2。联喹啉-4，4'-二羧酸钠

lg，无水碳酸钠2g，酒石酸钠0. 16g，氢氧化钠0. 4 g与

碳酸氢钠0.95g，加水使溶解成100ml，调节p H 值至

11.25,作为甲液；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液。临用

前取甲液100ml，加人乙液2ml，混匀，即得。

对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白

(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并

制成每l m l中含0. 8 m g的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备

(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。

测定法 精密量取对照品溶液0. Oml、0. lml、

0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml (对照品溶液取用量可在

本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各

加水至0.5ml，再分别加人铜- B C A试液10. Oml，立即混

通则匀，置37°C水浴中保温3 0分钟，放冷，照紫外-可见分光

光度法（通则0401)，立即在562mn的波长处测定吸光度；

同时以0 号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的

吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，

同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓

度，并乘以稀释倍数，即得。

第五法考马斯亮蓝法（Bradford法） •

本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G2 5 0与蛋白质分

子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成蓝色

复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以

蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋

白质的含量。

本法灵敏度高，通常可测定1?200Mg 的蛋白质量。

本法主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、十二烷基

硫酸钠（S D S )等，供试品缓冲液呈强碱性时也会影响

显色。

试剂酸性染色液取考马斯亮蓝G250 0. lg，加乙

醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml, 混

匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉

淀产生，使用前需经滤过。

对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白

(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并

制成每l m l中含l m g的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备

(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。

测定法精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml、0. 02ml,

0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml (对照品溶液取用量

可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管

中，各加水至0.1ml，再分别加人酸性染色液5.0ml，立

即混匀，照紫外-可见分光光度法（通则0401) ，立即在

5 9 5 n m的波长处测定吸光度；同时以0 号管作为空白。

以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方

程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回

归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍

数，即得。

【附注】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色

皿（如石英比色皿），建议使用玻璃比色皿或其他适宜材

料的比色皿。

第六法紫外-可见分光光度法

本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色

氨酸等芳香族氨基酸，其在2 8 0 n m波长处具zui大吸光度，

在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。

本法操作简便快速，适用于纯化蛋白质的检测，一般

供试品浓度为0.2?2mg/ml。本法准确度较差，干扰物质

多。测定法（2) 适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白

质测定。

对照品溶液与供试品溶液的制备照各品种项下规定

通则52

的方法制备。

测定法 （1 )取供试品溶液，照紫外-可见分光光度

法（通则0401)，在2 8 0 n m的波长处测定吸光度，以吸收

系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。

( 2 )取供试品溶液，照紫外-可见分光光度法（通则

0401)，在28 0 n m与2 6 0 n m的波长处测定吸光度，按下式

计算供试品中蛋白质的含量。*

蛋白质浓度（mg/ml) =1. 4 5 X A 28。一0. 7 4 X A 260