3 1 0 2唾液酸测定法

(间苯二酚显色法）

本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状

态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再

用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。

睡液酿对照品溶液（200pg/inl)的制备精密称取唾液

酸对照品10.52mg(lMg 唾液酸相当于3. 24mnol)，置10ml

量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液

( lm g /m l) ,按一次使用量分装，一7CTC贮存，有效期1 年。

仅可冻融1次。4°C保存使用期为2 周。精密量取唾液酸贮

备液l m l ,置5m l量瓶中，加水至刻度，即为每lm l含

200Mg 的唾液酸对照品溶液，用前配制。

用于C 群脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗唾液酸含量测定时，

同法制备浓度为400Mg /m l的唾液酸对照品溶液贮备液（精

密称取唾液酸40mg，置100ml量瓶中，用纯化水溶解并定

容至刻度，混匀，即得）。精密量取唾液酸贮备液2.0ml，

置10ml量瓶、中，加水至刻度，即为每lm l含唾液酸80邶的

唾液酸对照& 溶液，用前配制。

测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度为每

. 226 .

lm l含0.2.0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对

照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀，每

管再加人间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2% 间苯二酚溶液

2.5ml、0. lm o l/L 硫酸铜溶液 62. 5^1、25% 盐酸溶液 20ml，

加水稀释至25ml，混勻。试验前4 小时内配制）lm l，加盖，

沸水煮沸3 0分钟（水浴面高于液面约2cm)，取出置冰浴中3

分钟（同时振摇)后，每管加乙酸丁酯-丁醇溶液（取4 体积乙

酸丁酯与1 体积丁醇混匀，室温下保存，1 2小时内使用）

2ml，充分混匀，室温放置1 0分钟，照紫外-可见分光光度

法（通则0401)，在波长580nm处测定吸光度。

唾液酸含量(Mg)

供试品

空白2 4 5 6 8

唾液酸对照品溶液(卩1) 10 20 25 30 40

水( Ml) 100 90 80 75 70 60

供试品溶液( Ml) 100

脑膜炎球菌疫苗唾液酸含量测定：取含唾液酸约4CVg/ml

的供试品溶液和纯水对照各2ml, 另分别取唾液酸对照品

(80/^g/ml) 0. lm l、0.2ml、0_4ml、0_ 8ml、1.6ml 于各管中，

补水至2，O m l为标准曲线各点。各管加2 m l显色剂

(0. lm o l/L硫酸铜溶液0.5ml、4%间苯二酚溶液5ml，浓盐

酸80ml，补水至100ml混匀。临用现配）摇匀，沸水浴15

分钟后冰浴5.10分钟，每管加4m l有机相（正丁醇15ml，

加乙酸丁酯定容至100ml)，充分摇匀后置室温10分钟。以

纯水对照为0 点，于585nm测定吸光度，并作直线回归。

(可按比例缩小供试品及各试剂体积）

以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回

归（相关系数应不低于0 .99)，由直线回归方程计算5Mg 唾液

酸的吸光度值，再按下式计算供试品唾液酸含量。

促红素供试品唾液酸含量— A 2X 5X3. 2A XW X n

(mol/mol 蛋白质） A7XPXTOO

式中烏为5Mg 唾液酸的吸光度；

A 2为供试品的吸光度；

. 为供试品稀释倍数；

P 为供试品蛋白质含量，Mg /p l;

W 为lrn n o l促红素的量（不包括糖成分量），相当

于 30. 6/xg0

脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗供试品唾液酸含量（/ x g /m l) =

A X n中A 为供试品溶液吸光度相对于唾液酸对照品溶液的浓

度，fig /m li

n 为供试品的稀释倍数。